Lễ hội Đền Mẫu Âu Cơ được tổ chức vào những ngày đầu tháng Giêng hằng năm. Lễ chính được tổ chức vào sáng mồng 7 tháng Giêng với nghi lễ rước kiệu và lễ Tế nữ quan. Tế nữ quan là một nghi lễ quan trọng, linh thiêng bậc nhất trong Lễ hội Đền Mẫu Âu Cơ. Sau nghi lễ rước kiệu từ Đình Đức Ông, Lễ Tế nữ quan được thực hiện tại sân Đền với những nghi thức truyền thống, mang đậm nét đẹp của tín ngưỡng thờ Mẫu Âu Cơ. 

Thực hiện nghi lễ Tế nữ quan là các em nữ sinh được lựa chọn tại Trường THPT Hạ Hòa và THPT Xuân Áng (huyện Hạ Hòa). Đó là các em nữ sinh thanh tân, có ngoại hình xinh đẹp, phẩm hạnh tốt, gia đình hạnh phúc, không có tang. Trước ngày diễn ra Lễ Tế nữ quan, đội tế đã dày công tập luyện gần một tháng để thuần thục các nghi thức, động tác trong bài tế.